Norovirus Smartphone: Usando megapixels e microfluídicos para combater o outro tipo de infecção por vírus

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As chances são muito boas de que, em algum momento de sua vida, você tenha cruzado o caminho com um norovírus. E é provável que você se lembre do encontro vividamente, ou pelo menos depois dele. Lembro-me de um desentendimento com o inseto em um Natal, quando meus pais trouxeram mais do que apenas brinquedos para as crianças quando eles visitaram. Dentro de um dia, todos na casa estavam compartilhando a alegria. Era a estação; eles não chamam de inseto de vômito de inverno por nada.

A maioria das 685 milhões de infecções por norovírus a cada ano desaparece após alguns dias miseráveis, mas algumas requerem hospitalização e 200.000 delas resultam em morte, principalmente por desidratação e principalmente por crianças. Um meio fácil de usar, barato e preciso de detectar o vírus em campo seria um grande benefício para a saúde pública. E em breve, os smartphones poderão fazer exatamente isso.

Do laboratório ao campo

Há muito debate sobre se os vírus constituem vida ou não, mas uma coisa é certa: os vírus estão perfeitamente adaptados à sua missão. Consistindo em pouco mais que um genoma despojado, os vírus representam o conjunto mínimo de recursos necessários para replicar em uma célula hospedeira. Como tal, não há muito o que fazer ao tentar identificar vírus; eles não têm metabolismo próprio, não crescem por divisão celular e são pequenos demais para serem vistos com algo que não seja o microscópio eletrônico.

No laboratório, os vírus são geralmente identificados por métodos que têm como alvo o genoma ou o revestimento protéico que o protege. Os métodos genômicos incluem a reação em cadeia da polimerase (PCR), que amplifica o tamanho minúsculo de DNA ou RNA dentro do vírus (amplificar o genoma de vírus RNA como norovírus requer primeiro transformar o RNA em DNA com uma enzima chamada transcriptase reversa; esse processo é conhecido como RT-PCR.) Os métodos de PCR produzem bilhões de cópias do genoma que podem ser facilmente detectadas usando eletroforese em gel ou outros métodos. A detecção da cápsula protéica é feita com imunoensaios, onde anticorpos específicos para uma das proteínas do revestimento se ligam às partículas do vírus; esses anticorpos são então detectados por anti-anticorpos que têm um marcador radioativo ou fluorescente anexado a eles.

Uma captura padrão ou ELISA “sanduíche” (ensaio imunossorvente ligado a enzima). Os anticorpos para a proteína de interesse estão ligados a uma matriz. A proteína é adicionada, adere aos anticorpos ligados e, em seguida, é adicionado um anti-anticorpo marcado. Fonte: AntibodiesOnline.com

Embora ambos os métodos sejam simples em laboratório, eles são impraticáveis ​​em campo e requerem instrumentação cara. Para resolver o problema de identificar rapidamente o norovírus em condições do mundo real, uma equipe da Universidade do Arizona desenvolveu um método exclusivo de detecção de vírus microfluídicos. A idéia é semelhante ao imunoensaio "sanduíche" usado no laboratório, mas com algumas reviravoltas.

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Agrupamentos fluorescentes

Esquema dos canais microfluídicos utilizados na detecção de norovírus. Linhas pretas grossas são os canais impressos em cera; quatro canais são impressos em cada pedaço de papel nitrocelulose. Fonte: ACS Omega 2019, 4, 6, 11180-11188.

A primeira inovação é o uso de papel microfluídico. O papel é um pequeno pedaço de papel de filtro de nitrocelulose, também conhecido como papel flash, no qual pequenos canais foram impressos com uma impressora de tinta sólida. O papel é então aquecido para derreter a tinta sólida cerosa nos poros do papel, formando uma barreira hidrofóbica. Uma pequena quantidade de amostra aquosa suspeita de estar contaminada com norovírus é adicionada ao papel; a amostra absorve os poros do papel por ação capilar e se espalha ao longo do canal, mas é impedida de migrar muito longe pelas barreiras cerosas.

Em seguida, um anticorpo marcado com fluorescência específico para uma das proteínas de revestimento do norovírus é adicionado ao canal. A solução de anticorpo é rapidamente puxada para o papel, onde se liga a qualquer partícula de norovírus. Os anticorpos se acumulam em cada partícula, formando grandes grupos fluorescentes que são facilmente detectados ao microscópio. Normalmente, isso é feito com um microscópio de fluorescência no laboratório, mas a equipe também tem um truque para isso.

Usando um microscópio óptico pronto para uso e um filtro passa-banda a 480 nm, eles transformaram um smartphone comum em um microscópio de fluorescência portátil e específico para fins específicos. O microscópio prende a lente da câmera enquanto o filtro passa pelo LED branco para fornecer a luz azul de excitação necessária para visualizar os conjugados de anticorpos fluorescentes; a equipe ressalta que um LED azul separado também funcionaria. Graças à microfluídica, os aglomerados estão bem distribuídos ao longo do canal, facilitando a contagem com o software de análise de imagem que roda diretamente no telefone. Quanto mais aglomerados, maior a carga viral na amostra.

O anexo do smartphone e os aplicativos necessários para detectar a carga de norovírus em amostras de campo. Observe a luz azul de um filtro passa-banda de 480 nm sobre a luz da câmera; um LED azul separado pode ser substituído. Fonte: ACS Omega 2019, 4, 6.11180-11188

A análise da imagem no telefone é baseada no MATLAB. Os anticorpos fluorescentes emitem luz em torno de 525 nm quando estimulados com luz azul. O programa usa os dados dos canais vermelho e verde da câmera enquanto ignora o azul, capturando o comprimento de onda emitido e bloqueando a luz de excitação. Os corpos fluorescentes são isolados do ruído de fundo e contados se excederem o tamanho de corte. O aplicativo gera uma leitura em menos de um minuto, sem a necessidade de uma conexão com a Internet.

Toda a configuração do hardware custa cerca de US $ 50, sem incluir o telefone. A equipe conseguiu mostrar que o sistema pode detectar norovírus em uma única cópia de vírus por microlitro de água pura ou 10 cópias por microlitro em águas residuais recuperadas, um cenário de campo mais realista. Todo o kit é fácil e barato de montar, não é necessário nenhum conhecimento específico para operá-lo, e todos os materiais e reagentes, incluindo os anticorpos e as etiquetas fluorescentes, estão disponíveis comercialmente.

Inovações na detecção de agentes infecciosos como esse podem realmente ser um benefício para a saúde pública. A alavancagem da crescente capacidade computacional e dos recursos de sensores dos smartphones pode levar a modalidades de detecção de uma ampla variedade de patógenos com maior sensibilidade, o que pode levar a uma melhor prevenção e maior qualidade de vida para milhões.

(via Tech Xplore)

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